Muestras de tejidos de momias con los nombres "María" y "Vavita" fueron enviadas desde Perú a un laboratorio ruso para su investigación. Las muestras proporcionadas de tejidos biológicos se estudiaron mediante microscopía electrónica de barrido, espectros Raman, ICPE, se estudió la composición de la tierra de diatomeas (una sustancia en la superficie de la piel de las momias). También se realizó un estudio del ADN de los tejidos transferidos.
preparación de la muestra
Se transfirieron muestras de tejido, de 500 µg cada una, a tubos de plástico y se disolvieron en 1 ml de tampón (Tris-HCl 10 mM pH = 10,5, EDTA 1 mM, NaCl 0,15 M). A las suspensiones resultantes, se añadió dodecilsulfato de sodio al 0,5%, se calentó a +80 ° C y, después de 10 minutos, se colocó proteinasa K (hasta 500 μg / ml) en un termostato (+55 ° C) durante 24 horas.
norte
La desproteinización se realizó por el método fenólico: agregando fenol en igual volumen a la suspensión, luego fenol: cloroformo (1: 1), cloroformo; después de cada adición, se realizó una agitación constante en un rotor angular y una centrifugación a 15 mil rpm, 10 min.
Al super-sedimento obtenido después de la 3ª centrifugación se le añadió 1/10 del volumen de NaCl 1 M y 2,5 volúmenes de alcohol etílico dos veces destilado, y se dejó durante la noche a -30ºC en tubos de ensayo cónicos - "Eppendorf". La centrifugación se realizó a 15 mil vol. min. en 10 minutos y recibió el ADN "precipitado" en forma de un precipitado marrón. El sedimento de ADN se lavó dos veces con alcohol etílico al 70% y se secó a temperatura ambiente (1 h) y luego se disolvió en tampón TE.
La PCR se realizó en un termociclador programable "My Cycler" ("Bio = Rad") usando oligoprimers estándar sintetizados por el método de fase sólida en la asociación "Beagler" (San Petersburgo). La mezcla de reacción para la amplificación con un volumen de 25 μL incluía: 15 nM de cada oligocebador, Tris-HCl 67 mM pH = 8.8 a +25 C, (NH4) SO4 16.6 mM, MgCl2 6.7 mM, EDTA 6.7 μM, 2 mercaptoetanol 10 mM, 170 μg / ml de BSA y una mezcla de cuatro dNTP básicos a una concentración de 1,0 mM cada uno y ADN polimerasa termoestable Thermus thermophilis (5 U / μl) (NPO SibEnzim). Después de la desnaturalización (10 min, 94 ° C), se llevaron a cabo 35 ciclos de amplificación para cada sistema de prueba: 94 ° C -1 min, 58 ° C -1 min, 72 ° C -1 min. Para controlar la especificidad, se introdujeron en la reacción muestras de ADN con genotipos conocidos para los loci estudiados (sistemas de marcadores), así como muestras de control.que contiene una mezcla de reactivos sin ADN. Después de la amplificación, se añadió un tampón de tinción a alícuotas de la mezcla de reacción (7 μl) y se separó por electroforesis vertical en gel de poliacrilamida al 6% (210x150x1 mm), se tiñó con bromuro de etidio y se fotografió bajo luz ultravioleta. Para identificar los alelos, se utilizaron estándares alélicos correspondientes a estos loci ("escaleras").
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Análisis de ADN
Para el estudio, utilizamos el método de análisis de exoma de ADN humano basado en secuenciación de alto rendimiento con enriquecimiento por hibridación.
Técnica de análisis del exoma del ADN humano.
Se analizaron 2 muestras … Todas las etapas de preparación de la muestra antes de la PCR se llevaron a cabo en salas blancas. La preparación de muestras, la extracción de ADN y la amplificación de fragmentos de ADN individuales se realizaron en diferentes salas.
Se ligaron adaptadores específicos (KAPA Library Preparation Kit y SeqCap Adapter Kit; Roche) a los extremos del ADN fragmentado genómico (~ 5 ng), después de lo cual se llevó a cabo una selección de fragmentos en dos etapas en el rango de longitud de 200-350 pb utilizando AMPureXP Beads (Beckman Coulter) … Los fragmentos resultantes se amplificaron con cebadores específicos del adaptador y se hibridaron con sondas específicas biotiniladas (NimbleGen SeqCap EZ Choice MedExome; Roche) durante 28 ha 47 ° C. En una reacción, se combinaron dos muestras de ADN. Se aislaron híbridos de sonda-ADN biotinilados y se purificaron con partículas magnéticas conjugadas con estreptovidina; se realizó una segunda amplificación y evaluación cualitativa de la biblioteca de ADN resultante (TapeStation 4200; Agilent Technologies). Con el fin de eliminar los fragmentos de amplificación fuera del objetivo y los dímeros adaptadores, la biblioteca de ADN se volvió a purificar utilizando partículas magnéticas AMPureXP Beads (Fig. 1). La concentración final de la biblioteca preparada se evaluó en un instrumento Quantus usando un sistema comercial QuantiFluor® dsDNA (Promega). La biblioteca de ADN resultante se inmovilizó sobre la superficie de la celda de flujo. La secuenciación se realizó en la plataforma Illumina utilizando una celda de flujo estándar y el kit de reactivos MiSeq v2 300 (2 × 150 ciclos). La biblioteca de ADN resultante se inmovilizó sobre la superficie de la celda de flujo. La secuenciación se realizó en la plataforma Illumina utilizando una celda de flujo estándar y el kit de reactivos MiSeq v2 300 (2 × 150 ciclos). La biblioteca de ADN resultante se inmovilizó sobre la superficie de la celda de flujo. La secuenciación se realizó en la plataforma Illumina utilizando una celda de flujo estándar y el kit de reactivos MiSeq v2 300 (2 × 150 ciclos).
Figura: 1
Evaluación general de la calidad del ADN secuenciado
Se utilizaron métodos estándar como FastQC y los programas Jellyfish y KraTER para la evaluación inicial de la calidad. La evaluación de calidad no mostró problemas de calidad con las lecturas de ADN secuenciadas para ambas muestras. Las imágenes no se muestran porque no son informativas.
Para la primera muestra (más M, momia grande "Maria"), se secuenciaron 113.4M lecturas, para la segunda muestra (más W, momia pequeña "WaWita") se secuenciaron 22.9M lecturas.
El siguiente paso fue limpiar las lecturas secuenciadas de varias secuencias técnicas que interferirían con análisis posteriores. Para ello se utilizó el programa Cookiecutter. Después de la limpieza, hubo 113,3 millones (99%) de lecturas y 22,8 millones (99%) de lecturas, respectivamente, para M y W.
Estimación de la cantidad de ADN antiguo y su separación del moderno
El método estándar para evaluar la presencia y la cantidad de ADN antiguo es estimar la cantidad de nucleótidos dañados por el tiempo. Para ello se utilizó el programa MapDamage 2.0. MapDamage 2.0 que mostró la cantidad de ADN antiguo en 30.1%, pero dado que MapDamage implica que estamos usando una referencia cercana, y no sabemos exactamente qué tan cerca están ambas muestras del genoma de los humanos modernos, y usamos una biblioteca de exoma, este método en sí no fue suficiente. Otro buen método para evaluar el ADN antiguo es el número de fragmentos cortos.
La filtración del supuesto ADN antiguo se llevó a cabo en tres etapas. En la primera etapa, eliminamos todas las lecturas emparejadas que no se pueden cruzar y ensamblamos en una lectura no emparejada con superposición. Estas lecturas indicaron que el fragmento original que se secuenció tenía más de 300 pb. y probablemente ADN moderno. Entonces, después de este paso, quedaron 86,9% y 91,8%, respectivamente. Después de eso, se seleccionaron fragmentos superpuestos únicos para que su longitud fuera menor de 150 pb, ya que esta es la longitud que esperábamos para el ADN antiguo. Tras este paso, quedaron 8,6% y 38,5%, respectivamente, para las muestras M y W. Cabe destacar que a pesar de la diferencia en porcentaje, el número absoluto de lecturas entre las muestras M y W es muy similar: 9,8M y 8,8M, lo que se explica por el hecho de que el contenido de ADN antiguo en ambas muestras es similar.
| Parámetro | Muestra M (Maria) | Muestra W (Wawita) |
| Numero de lecturas | 113,3 millones | 22,8 millones |
| Porcentaje de fragmentos cortos <300 pb | 86,9% | 91,8% |
|
Porcentaje de fragmentos cortos <150 pb (número) |
8,6% (9,846,035) |
38,5% (8 813 220) |
|
Porcentaje de fragmentos alineados por genoma humano (número) |
2,03% (2,345,084) |
9,65% (2.264.551) |
| Porcentaje de fragmentos alineados por genoma humano de corto <150 pb | 23,8% | 25,6% |
Obtención de ADN similar al genoma humano de referencia
El ADN antiguo putativo resultante se asignó a un genoma humano de referencia utilizando una tubería de búsqueda de variantes genómicas estándar utilizando BWA, samtools y Wcftools.
Además, solo el 23,8% de la muestra M y el 25,6% se mapearon con éxito en el genoma de referencia de los humanos modernos. Al mismo tiempo, para ambas muestras, el 75% de las lecturas secuenciadas no pudieron mapearse en el genoma humano. Esto se puede explicar tanto por la contaminación como por el hecho de que estas muestras se encuentran lo suficientemente lejos del genoma de los humanos modernos. Al mismo tiempo, vale la pena tener en cuenta que hemos secuenciado la biblioteca de exomas y, por lo tanto, minimizado la contaminación del ADN bacteriano.
El análisis de reconocimiento inicial de las lecturas crudas mostró que algunas de ellas pertenecían a ADN repetitivo específico de ungulados, esto puede explicarse por el hecho de que se utilizó grasa de llama en la momificación.
Para un análisis más detallado, se necesitan aproximadamente tres semanas de cálculos, ya que las soluciones existentes se hicieron solo para genomas virales y bacterianos, y necesitamos comparar con todos los genomas existentes, incluidos los genomas de plantas, para comprender qué especies se secuenciaron.
Características de las opciones encontradas
Las lecturas mapeadas se utilizaron para buscar variantes que distinguen las muestras M y W del genoma humano moderno, así como para evaluar la contaminación de las lecturas del cromosoma Y humano.
La primera pregunta que debía responderse era a qué cromosomas se mapearon las lecturas secuenciadas.
Como sabemos que las muestras de María se aislaron de huesos y músculos, y las de Vavita solo de huesos, esperábamos una diferencia en la cantidad de ADNmt. Pero no hubo mucha diferencia.
El número de lecturas mapeadas en Y es otra prueba de contaminación por humanos modernos. Curiosamente, resultó ser el mismo en ambas muestras.
Las estadísticas de las variantes encontradas se muestran a continuación:
| Parámetros | Muestra M (Maria) | Muestra W (Wawita) |
| Número de opciones encontradas | 79957 | 48941 |
| Número de opciones en Y | 534 | 541 |
| La cantidad de opciones confiables (más de 20 lecturas y más de 30 de calidad) | 16969 | 6181 |
| Variantes con rsid conocido (disponibles en la base de datos de snip) | 5701 | 3089 |
| Opciones válidas generales | 92 | |
| opciones comunes con rsid | 49 |
Después de eso, fue posible responder a la pregunta: ¿ son parientes M y W? La respuesta es no.
Solo se encontraron 49 variantes coincidentes entre M y W y 3040 diferentes para variantes con rsid conocido. Además, quizás se trate de diferentes tipos o subespecies de una persona o una criatura desconocida.
Curiosamente, las variantes con el cromosoma Y son idénticas para ambas muestras, lo que indica contaminación por la misma persona, y que en el ADN antiguo del cromosoma Y probablemente todavía no haya cromosoma.
Evaluación de la similitud con los genomas humanos secuenciados existentes del Proyecto 1000 Genoma Humano
Tenga en cuenta que este es solo un análisis aproximado, ya que para un análisis más preciso, se necesitan variantes de regiones del genoma bajo selección neutra, y tenemos datos del exoma.
Sin embargo, utilizando 5708 variantes para M o 3096 para S, fue posible realizar una variante del análisis en comparación con los datos de 1000 genomas humanos.
El resultado del análisis de PCA en la imagen siguiente es una superposición de dos imágenes para M y W, calculadas por separado, ya que hay muy pocas opciones comunes entre M y W para estimar las distancias entre M y W.
Puntuación de similitud.
Como puede ver, no hay coincidencia con ningún grupo de genes, también se diferencian entre sí. Pero debe tenerse en cuenta que usamos secuencias de codificación bajo selección, y se recomienda usar variantes bajo selección neutra.
Sin embargo, el resultado de la PCA está bien de acuerdo con la verificación manual de variantes, que mostró que los datos están en un homocigoto sin referencia, lo que nuevamente indica que las imágenes están lejos del genoma humano moderno.
Conclusión
Desafortunadamente, estábamos limitados a solo dos muestras, generalmente en este tipo de análisis se usan más, al menos 3-10 al menos relacionadas de alguna manera. Por tanto, es necesario seguir investigando con una gran cantidad de muestras.
Al mismo tiempo, lo más probable es que podamos concluir que las muestras de ADN de Mary y Vavita corresponden al ADN humano, pero no coinciden con el ADN disponible para nosotros de una base de datos de 1000 personas.
Autores del informe: Baranov V. S. y Aseev M. V. (Instituto de Investigación Científica de Obstetricia y Ginecología, Departamento de Diagnóstico Prenatal), Glotov A. S. y Glotov O. S. (Universidad Estatal de San Petersburgo), A. S. Komissarov (Instituto de Citología, Academia de Ciencias de Rusia, Centro de Bioinformática Genética).
Materiales proporcionados por Konstantin Georgievich Korotkov (Doctor en Ciencias Técnicas, Profesor, Universidad de Tecnologías de la Información, Mecánica y Óptica) y Dmitry Vladislavovich Galetsky (Candidato de Ciencias Médicas, I. P. Pavlov First St. Petersburg State Medical University).
Para obtener más información sobre las momias de Nazca, consulte la etiqueta: Momias de Nazca.
